Parallele chemische Proteinsynthese auf der Oberfläche zur schnellen Analyse der Phosphoregulierung von SH3‐Domänen

• Published in: Angewandte Chemie 2016-06, Vol.128 (25), p.7368-7373
• Main Authors: Zitterbart, Robert, Seitz, Oliver
• Format: Article
• Language: English
• Subjects: Abl; Entschwefelung; Immobilisierung; Native chemische Ligation; Proteinphosphorylierung
• ISSN: 0044-8249; 1521-3757
• DOI: 10.1002/ange.201601843

Mangelnde Verfügbarkeit erschwert die Analyse posttranslational modifizierter Proteindomänen, denn rekombinante Methoden vermitteln nur selten die gewünschte Ortsspezifität. Die Totalsynthese ermöglicht zwar eine nahezu vollkommene Kontrolle über posttranslationale und andere Modifikationen, jedoch bleiben chemische Methoden auf kürzere Peptide beschränkt. Zur Lösung dieses Problems präsentieren wir hier eine Methode, die a) Immobilisierung N‐terminaler Thio‐Peptidhydrazide über Hydrazonverknüpfung, b) native chemische Ligation auf der Oberfläche mit selbstgereinigten Peptidthioestern c) radikalisch induzierte Entschwefelung und d) einen oberflächenbasierten Fluoreszenzbindungs‐Assay zur funktionellen Charakterisierung kombiniert. Die Methode wurde zur schnellen Untersuchung von 20 SH3‐Domänen verwendet. Die Analyse lässt schließen, dass Tyrosinphosphorylierung der SH3‐Domänen in Abl‐Kinasen als Schalter fungiert, der sowohl einen Verlust als auch einen Gewinn an Affinität für prolinreiche Liganden induzieren kann. Eine Überholspur zur Analyse der Proteinphosphoregulierung wird durch Immobilisierung von Peptidhydraziden mittels Hydrazonverknüpfung, native chemische Ligation mit selbstgereinigten Peptidthioestern, radikalinduzierte Entschwefelung und einen Oberflächenbindungs‐Assay ermöglicht. Die Methode zeigt, dass Tyrosinphosphorylierung die Affinität der SH3‐Domänen von Abl‐Kinasen für prolinreiche Liganden sowohl verringern als auch erhöhen kann.