Proximitäts‐vermittelte kovalente Stabilisierung niedrig‐affiner Proteinkomplexe in vitro und in vivo

Die Charakterisierung von Proteinkomplexen geringer Affinität ist wegen ihrer Dynamik sehr anspruchsvoll. Hier wird eine Methode vorgestellt, um transiente Proteinkomplexe in lebenden Zellen mit einer kovalenten, aber konformativ flexiblen Brücke zwischen den Wechselwirkungspartnern zu stabilisieren...

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Published in:Angewandte Chemie 2017-12, Vol.129 (49), p.15943-15947
Main Authors: Cigler, Marko, Müller, Thorsten G., Horn‐Ghetko, Daniel, von Wrisberg, Marie‐Kristin, Fottner, Maximilian, Goody, Roger S., Itzen, Aymelt, Müller, Matthias P., Lang, Kathrin
Format: Article
Language:English
Subjects:
Chemistry
Guanosine triphosphate
Kovalente Stabilisierung
Nichtnatürliche Aminosäuren
Protein-Protein-Wechselwirkungen
Proteins
Proteinstrukturen
Proximitätsvermittlung
tRNA
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Description
Summary:Die Charakterisierung von Proteinkomplexen geringer Affinität ist wegen ihrer Dynamik sehr anspruchsvoll. Hier wird eine Methode vorgestellt, um transiente Proteinkomplexe in lebenden Zellen mit einer kovalenten, aber konformativ flexiblen Brücke zwischen den Wechselwirkungspartnern zu stabilisieren. Dazu wird eine hoch aktive Mutante der Pyrrolysyl‐tRNA‐Synthetase verwendet, die den Einbau nichtnatürlicher Aminosäuren mit langen Bromalkylketten (BrCnK) in Proteine ermöglicht. Erstmals wird gezeigt, dass Komplexe niedriger Affinität zwischen BrCnK‐haltigen Proteinen und deren Bindungspartnern in vivo in Bakterien sowie humanen Zellen stabilisiert werden können. Mit diesem Ansatz konnte die Kristallstruktur eines transienten, GDP‐gebundenen Komplexes zwischen einem kleinen G‐Protein und seinem GTP‐Austauschfaktor bestimmt werden. Die Methode kann als generelles Hilfsmittel zur Validierung und Charakterisierung von Protein‐Protein‐Wechselwirkungen in vitro und in vivo eingesetzt werden. Vermittelt durch Proximität: Der positionsspezifische Einbau strukturell flexibler nichtnatürlicher Aminosäuren (BrCnK) ermöglicht die kovalente Stabilisierung von niedrig‐affinen und transienten Protein‐Protein‐Wechselwirkungen unter nativen Bedingungen. Dieser Crosslinking‐Ansatz ist eine geeignete Methode zur Cokristallisation und Strukturbestimmung von niedrig‐affinen Proteinkomplexen.
ISSN:0044-8249
1521-3757
DOI:10.1002/ange.201706927