Cyclopropene als Chemische Reporter für die Duale Bioorthogonale und Orthogonale Metabolische Markierung von DNA

• Published in: Angewandte Chemie 2024-05, Vol.136 (22), p.n/a
• Main Authors: Seul, Nicola, Lamade, Dennis, Stoychev, Petko, Mijic, Michaela, Michenfelder, Rita T., Rieger, Lisa, Geng, Philipp, Wagenknecht, Hans‐Achim
• Format: Article
• Language: English
• Subjects: 2’-Desoxyuridin; Biokonjugation; Cyanin; Deoxyribonucleic acid; DNA; DNA-Polymerase; Farbstoffe; Oligonukleotide
• ISSN: 0044-8249; 1521-3757
• DOI: 10.1002/ange.202403044

Die duale bioorthogonale Markierung ermöglicht die Untersuchung und das Verständnis von Wechselwirkungen in der biologischen Umgebung, die mit einer einzigen Markierung nicht zugänglich sind. Eine Herausforderung bleibt jedoch die Anwendung von zwei bioorthogonalen Reaktionen in der gleichen Umgebung aufgrund von Kreuzreaktivität. Um dieses Problem für die duale und orthogonale Markierung von DNA zu lösen, haben wir zwei unterschiedlich modifizierte 2′‐Desoxynukleoside entwickelt. Mit Hilfe der Diels‐Alder‐Reaktion mit inversem Elektronenbedarf und Photoklick‐Reaktion wurde genomische DNA in Zellen mit zwei verschiedenen fluorogenen Markern verknüpft. Aus einer kleinen synthetischen Bibliothek aus 1‐ und 3‐methylcyclopropenyl‐modifizierten 2′‐Desoxynukleosiden wurden zwei 2′‐Desoxyuridine identifiziert, die am schnellsten in jeweils einer der beiden bioorthogonalen Reaktionen reagieren. Ihre orthogonale Reaktivität konnte in vitro nachgewiesen werden. Ihre Replikationseigenschaften als Ersatz für Thymidin wurden in Primerverlängerungsexperimenten untersucht, um die anschließenden Markierungsreaktionen an DNA abzuschätzen. Schließlich wurde eine duale, orthogonale und metabolische Fluoreszenzmarkierung von genomischer DNA in HeLa‐Zellen nachgewiesen. Es wurde ein experimentelles Protokoll entwickelt, das den intrazellulären Transport und den metabolischen DNA‐Einbau der beiden 2′‐Desoxyuridine mit der anschließenden dualen bioorthogonalen Markierung unter Verwendung eines fluorogenen Cyanin‐Styryl‐Tetrazins und eines fluorogenen Pyren‐Tetrazols kombiniert. Diese Ergebnisse sind von grundlegender Bedeutung für fortgeschrittene metabolische Markierungsstrategien für Nukleinsäuren in der Zukunft, insbesondere in lebenden Zellen. Durch die Kombination der Diels–Alder‐Reaktion mit einem fluorogenen Cyanin‐Styryl‐Tetrazin‐Farbstoffkonjugat und der Photoclick‐Reaktion mit einem Pyren‐Tetrazol unter Verwendung isomerer Cyclopropene als chemische Reporter wurde eine doppelte biorthogonale und orthogonale metabolische Markierung von genomischer DNA in HeLa‐Zellen nachgewiesen.