过表达TrxR1重组HEK293细胞株的构建和鉴定

目的 构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型.方法 通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株.后续研究分为3组进行:①TrxR1过表达HEK293细胞:pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞:pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1...

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Published in:南方医科大学学报 2022, Vol.42 (4), p.554-560
Main Authors: 吕晓梅, 周知音, 朱丽, 周吉, 黄慧丹, 张超, 刘晓平
Format: Article
Language:Chinese
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Description
Summary:目的 构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型.方法 通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株.后续研究分为3组进行:①TrxR1过表达HEK293细胞:pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞:pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性.结果 构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1.与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升(P
ISSN:1673-4254
DOI:10.12122/j.issn.1673-4254.2022.04.11