Hemming av lysosomale cysteinproteaser ved fotodynamisk terapi (PDT)

• Main Author: Yadollahi, Mandana
• Format: Dissertation
• Language: Norwegian
• Subjects: cathepsin B; cysteinproteaser; legumain; PCI; PDT

Mange ondartede krefttyper har vist seg å være relativt resistente mot forskjellige typer ikke-kirurgiske terapier. Derfor er det et stort behov for utvikling av nye metoder for behandling av kreft, inkludert ovariekreft. Fotodynamisk terapi (PDT) er en selektiv behandlingsmetode for flere krefttyper, som er basert på akkumulering av fotosensitizere (PS) i kreftvev, aktivering av PS ved belysning og videre skade på tumorceller. En annen metode er en ny teknikk som heter fotokjemisk internalisering (PCI) som tar utgangspunkt i PDT og er utviklet for å frigjøre legemidler fra endosomer til cytosol før degradering i lysosomer ved å bryte membraner til endocytiske vesikler slik at legemiddelet skal kunne utøve sin intracellulære effekt på kreftceller. Lysosomale cysteinproteaser deltar i prosesser for kreftutvikling og -progresjon, samt celledød. PDT er vist å ha effekt på cathepsin B og L, men en eventuell effekt på legumain er ukjent. I denne studien ble ovariekreftcellelinjen SKOV-3 brukt som cellemodell og effekten av PDT på aktivitet, sekresjon og molekylære former til lysosomale cysteinproteaser (spesielt legumain og cathepsin B), ble studert. Videre ble det undersøkt hvordan internalisering av prolegumain og legumain- og cathepsin-inhibitorer (cystatin E/M og E64d) påvirker celleviabilitet etter PDT. I tillegg ble effekt av internalisering av inhibitorene på aktivitet og molekylære former av legumain og cathepsin B, og lysosomale størrelser studert. Sammenligning av PDT og PCI (med gelonin) på celleviabilitet ble også undersøkt. MTT-assay ble brukt for måling av celleviabilitet. Immunfargingsmetoder og fluorescensmikroskopi ble brukt for deteksjon av endo/lysosomale størrelser. Immunoblotting ble brukt for å finne molekylære former til cysteinproteasene. For å finne konsentrasjon av sekrert legumain ble ELISA brukt. Behandling med PDT førte til en signifikant reduksjon i både legumain- og cathepsin B-aktivitet i cellelysater. Både PDT- og PCI-behandling forårsaker signifikant reduksjon av celleviabilitet, men PCI av gelonin resulterter i en signifikant større reduksjon sammenlignet med PDT. Immunoblotting av cellelysat etter PDT-behandling viste reduksjon av både aktiv (36 kDa) og intermediære former (46/47 kDa) av legumain, aktive former (29 og 25 kDa) av cathepsin B, og aktiv form (33 kDa) av cathepsin L. Behandling med E64d (en generell cathepsin-hemmer) i 4 timer før PDT førte til at celledød ble motvirket sammenlignet med kontroll. Behandling av ce