Sequencing-basierte Detektion von BRCA1/2-Mutationen sowie -CNVs im Rahmen der genetischen HBOC-Routinediagnostik

• Main Authors: Honisch, E, Hinssen, N, Vesper, AS, Fehm, T, Niederacher, D
• Format: Conference Proceeding
• Language: ger
• ISSN: 0016-5751; 1438-8804
• DOI: 10.1055/s-0035-1560014

Aufgrund hoher Kosten sowie limitiertem Durchsatz war die genetische Prädispositionsdiagnostik in hereditären Mamma- und Ovarialkarzinom (HBOC)-Patienten bisher weitgehend auf die Gene BRCA1/2, RAD51C und CHK2 begrenzt. NextGen Sequencing (NGS) hingegen ermöglicht eine schnelle, kostengünstige und parallele Analyse von Millionen DNA-Molekülen. Um die Eignung dieser Technologie für die genetische HBOC-Routinediagnostik zu testen, wurde der Nachweis eines breiten Spektrums an BRCA1/2-Keimbahnmutationen mittels eines Benchtop-NGS Systems untersucht. Patientenspezifisch indexierte Sequenzierlibraries wurden mittels Multiplex-PCR (BRCA MASTRTM Dx, Multiplicom) generiert, auf dem MiSeq-System (Illumina) per paired-end Sequenzierung (2 × 250 bps) analysiert und durch einen etablierten IT-Workflow (Sophia Genetics, Genf) bioinformatisch hinsichtlich Einzelnukleotid-Varianten (SNVs), kurzer Insertionen/Deletionen (InDels) und großer genomischer Deletionen/Duplikationen (copy number variations, CNVs) in BRCA1/2 ausgewertet. Zur Methoden-Validierung wurden für konstitutive BRCA1/2-Mutationen vorcharakterisierte HBOC-Patienten (n = 100) per NGS analysiert. Hierbei wurden alle Veränderungen detektiert, darunter Mutationen in Homopolymerbereichen. Zudem wurde die diagnostisch angestrebte Mindestsequenziertiefe von 100-fach für den kompletten genomischen Zielbereich erreicht. Homo- und heterozygote sowie potentiell falsch-positive SNVs/InDels liessen sich anhand differierender Allelfrequenzen eindeutig voneinander abgrenzen. Alle 13 mittels MLPA-Analyse (MRC Holland) identifizierten Exon Deletionen/Duplikationen konnten per NGS-CNV Analyse nachgewiesen werden. Hierbei waren 70% der MLPA unauffälligen Proben auch in der NGS-CNV-Analyse eindeutig negativ, 30% wurden als nicht eindeutig auswertbar ausgewiesen, so dass sich durch die NGS-CNV-Analyse die aufwendige MLPA-Analyse auf rund ein Drittel der Proben reduzieren lässt. Nach Implementierung des validierten NGS-Workflows in die Routinediagnostik sind aktuell 370 HBOC-Patienten erfolgreich analysiert. NGS ermöglicht eine ausreichend sensitive und kostengünstige Detektion von BRCA1/2-Keimbahnmutationen in HBOC-Patienten. Die Technologie ist daher prädestiniert für eine Untersuchung weiterer relevanter Gene in dieser Patientengruppe im Rahmen sogenannter Panel-Analysen.